Исследование проницаемости эпигаллокатехин галлата (EGCG) через кожу

Изучение кинетики проникновения веществ через кожу является актуальной задачей фармакологии для создания наружных лекарственных средств и косметических препаратов. Традиционно для этого используется так называемая ячейка Франца – установка в которой имеется донорная и акцепторная камеры, разделенные мембраной. В качестве мембраны может быть использована кожа различных млекопитающих, рептилий, человека, трупный материал. Также применяются синтетические материалы. В нашей работе использовалась кожа свиного уха, как наиболее близкая по своим характеристикам к человеческой. Эпигалллокатехин галлат (EGCG) – натуральный полифенол из зеленого чая, он интенсивно изучается для применения в медицине и косметологии благодаря своим противораковым свойствам. Является сильным антиоксидантом, обладает противовоспалительными эффектами и имеются данные о его активности как ингибитора 5-альфа редуктазы. EGCG является гидрофильной молекулой и отлично растворяется в воде, поэтому его проницаемость может быть довольно низкой, что ограничивает его применимость в косметике. Целью работы было получить кинетические параметры проницаемости и накопления EGCG в коже.

Метод исследования

Исследование проводили на свиной коже середины внешней стороны уха в ячейках Франца, где в донорную ячейку помещали 1 мл 1% раствора EGCG, а акцепторную заполняли физ. раствором.

На поверхность кожи в ячейке Франца наносили 1 мл 1% раствора EGCG в физ. растворе, ответную часть ячейки заполняли водой. Выдерживали в течение 8 часов, отбирая из ответной части ячейки образцы через 0.5, 1, 2, 4 и 8 часов для определения количества EGCG методом ВЭЖХ. По окончании эксперимента кожу извлекали из ячейки, вырезали рабочий участок, который контактировал с раствором, высушивали бумажным полотенцем, десорбировали верхний наружный слой скотчем (трижды), взвешивали и замораживали в жидком азоте, после чего измельчали. К измельченному образцу добавляли 1 мл 0,1% раствора трипсина, после чего помещали в термостат с покачиванием образцов при 37 С в течение 12 ч. После этого, образец гомогенизировали на ультразвуковом гомогенизаторе до однородного состояния. К полученным гомогенатам добавляли 2 мл 70% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и встряхивали на Vortex в течение двух минут. После этого, образцы центрифугировали на 5000 об. в течение 15 минут. Супернатант использовали для количественного определения EGCG методом ВЭЖХ. Измерение проводили при скорости потока 150 мкл/мин, температура термостата 40 градусов, Элюент А- LiClO₄ 0,2 М и HClO₄ 0,05 М, Элюент Б-ацетонитрил. Линейный градиент от 5% до 50% Б за 2000 мкл. Колонка Prontosil 120-5-C18 AQ.

Результаты

На рисунке 1 представлен график накопления EGCG в акцепторной ячейке в зависимости от времени по средним значениям с учетом стандартной ошибки.

Рисунок 1. График накопления EGCG в акцепторной ячейке в зависимости от времени по средним значениям с учетом стандартной ошибки.

В таблице 2 представлены данные по накоплению EGCG в коже, в зависимости от времени контакта с донорской ячейкой. На рисунке 2 приведена кривая кинетики накопления EGCG по средним значениям.

Таблица 2. Значения измерений количества EGCG в коже в зависимости от времени.

Рисунок 2. График накопления EGCG в коже в зависимости от времени по средним значениям с учетом стандартной ошибки.

Расчет скорости проницаемости

В условиях «бесконечной дозы» (концентрация в донорной камере практически постоянна) после выхода на стационарный режим поток описывается первым законом Фика:J_ss=K_p*ΔC

где:

J_ss — стационарный поток (мкг·см⁻²·ч⁻¹);

K_p — коэффициент проницаемости кожи (см/ч);

ΔC — разность концентраций вещества по обе стороны рогового слоя

Экспериментально J_ss находят как наклон линейного участка зависимости  количества проникшего вещества от времени, нормированный на площадь диффузии:J_ss=dQ/A*dt

Где:

Q  — кумулятивное количество вещества в рецепторной камере,

A — площадь кожи в ячейке,

t— время.

Зная J_ss   и ΔC, коэффициент проницаемости вычисляют как:

K_p= J_ss/ ΔC

Коэффициент проницаемости K_p с учетом толщины слоя мембраны рассчитывается как:

K_p= J_ss/ C_donor

Коэффициент проницаемости P связанный с толщиной мембраны вычисляют как:

P=K_p*h

Где h это толщина слоя

Накопление в коже

t=120 мин. 19,90 мкг/г

t=240 мин.36,97 мкг/г

t=480 мин. 74,11 мкг/г

Линейная аппроксимация Q_skin (t)

dQ_skin/dt~9,07 мкг*г^-1*ч^-1

Для всей массы кожи в ячейке

dQ_skin,total/dt=9,07 мкг/г*ч * 0,333 г ~3,02 мкг/ч

Суммарный поток через кожу (кожа+акцептор)

Общая скорость поступления вещества из донора

dQ_skin,total/dt=dQ_acc+dQ_{ski, total}/dt~0,406+3,02~ 3,43 мкг/ч

Суммарный стационарный поток

J_total=dQ_total/dt/A=3,43/2,3116~1,48 мкг*см^-2*ч^-1

Коэффициент проницаемости с учетом накопления в коже

K_p,total=J_total/C_donor=1,48/10000~1,48*10^-4 см/ч

Пермеанс

P_total=K_p,total*h~1,48*10^-4*0,1311~1,94*10^-5 см²/ч

Итог с учетом количества вещества в коже:

Выводы

В работе была исследована проницаемость EGCG на ячейках Франца, где в качестве мембраны использовалась свиная кожа с внешней стороны уха. Была установлена кинетика проницаемости вещества EGCG в акцепторную ячейку, а также кинетика накопления в самой коже.

Измеренныйкоэффициент проницаемости K_p,total~1,48*10^-4 см/ч. Согласно градации проницаемости, K_p~10^-7-10^-8 см/c является низкой (характерно для крупных гидрофильных молекул)  , K_p~10^-6-10^-7 см/c  умеренной (липофильные низкомолекулярные соединения), а K_p выше 10^-6 см/c  высокой (очень липофильные небольшие молекулы с энхансерами). Значение K_p~1,48*10^-4 см/ч или ~4,1*10^-8 см/с ближе к верхней границе низкой и нижней границе умеренной, что в целом характерно для проницаемости такого типа молекул.

Что касается накопления вещества в коже, то в данном случае кожа — это не барьер для данного вещества, а депо. За весь эксперимент в неё попало в 7–8 раз больше вещества, чем прошло насквозь в акцептор. Это доминирующий процесс, а транскожный перенос — вторичный.

Соотношение скоростей накопления (кожа/акцептор) = 7.5x. Это говорит о том, что вещество имеет специфическое сродство к структурам кожи.

Наши данные говорят о том, что EGCG хорошо проникает в кожу и задерживается в ней. Что является ограничением для его использования в наружных средствах, где требуется поступление в системный кровоток. Если же мишень находится в самой коже, то такое поведение вещества является значительным преимуществом.